دانلود تحقیق آشنایی با وسایل آزمایشگاهی

آشنایی با وسایل آزمایشگاهی : آنس ( فلیدوپلاتین ) : که به دو نوع می باشد نوک تیز و حلقه ای که برای انواع کشت ها در محیط های مختلف به کار می رود .

پیست اتوماتیک : پیستی بسیار حساس و دقیق می باشد که دارای تنظیمی در قسمت فوقانی خود می باشد که می تواند از 1 سی سی تا 1000 سی سی تنظیم شود .

این دستگاه دارای قسمت های پلاستیکی می باشد که برای برداشتن مواد از آنها استفاده می شود و یکبار مصرف می باشند .

این اجزای پلاستیکی سر سمپلر می باشند .

فور : دستگاهی برای استریل کردن انکوباتور ( گرم خانه ) : که بعد از کشت برخی محیط ها را برای اینکه در محیط مناسب خود قرار گیرند در آن قرار می دهند .

دمای آن قابل تنظیم بوده همچنین می توان زمان را نیز برای آن تعریف نمود .

اتوکلاو : دستگاهی شبیه به یک زود پز بزرگ می باشد که برای استریل کردن از آن استفاده می شود.

استریلیزاسیون : روندی است که در طی آن همه اشکال میکروبی را اعم از اشکال فعال و اسپورها را از بین می بریم و آن ابزار و یا آن ماده مورد استفاده را عاری از هر گونه میکروب می کند .

استریلیزاسیون به دو صورت خشک و رطوبی انجام می شود .

Stril: ( Dry – wet – filter ) روش های کشت باکتری : هدف از کشت باکتری : باکتری را بتوانیم جدا ایزوله کنیم ( خالص کنیم ) مثلا حیوانی که مبتلا است ( بیمار است ) می توانیم عوامل بیماریزا را از او جدا کنیم و با شناسایی عوامل بیماریزا پی به ماهیت بیماری ببریم .

از کشت باکتریایی کمک می گیریم برای درمان بیماری ( تست آنتی بیوگرام ) که در این تست ها باکتری خالص شده را در اختیار داریم .

می توانیم داروهای متعدد را روی آن آزمایش کنیم و به هر کدام از داروها جواب داد در مورد انسان و یا دام استفاده کنیم .

تهیه واکسن ها : کشت های خالص را بدست می آوریم بعد آنتی ژنهای آن باکتری ها را جدا می کنیم و از آنها واکسن تهیه می کنیم .

محیط های کشت : الف : محیط کشت مایع : (Broth) آبگوشت ، مثال انواع محلولهای قندی مثل گلوکزبرات .

ب : محیط های جامد : Agar : یک پلی ساکارید است .

پلی ساکارید کمپلکسی است که باکتری ها می توانند آن را تجزیه کنند .

( سفت کننده است ) .

ما به طور معمولی محیط های جامد را داخل پلیت تهیه می کنیم ( یک تعدادی داخل لوله ) محیط های مایع همیشه داخل لوله تهیه می شوند .

ج : حالت نیمه جامد : آگار را به میزان کم دارد حالت ژل مانند .

از این محیط ها عمدتا جهت بررسی فاکتور حرکت در باکتریها استفاده می کنیم و در لوله هم تهیه می شوند .

روش های کشت : روش شعاعی : روش کشت T: 3- روش کشت ممتد : 4-کشت یک چهارم (4/1) روش های کشت در لوله : نوترینت آگار زرد رنگ طلایی می باشد .

چهار محیط را ما در این آزمایش کشت دادیم .

در یک پلیت که زرد رنگ بود ( نوترینت آگار ) از محیط e3 کشت دادیم .

در مایع قندی که قرمز روشن بود از محیط e1 کشت دادیم .

در SIM که زرد روشن بود از محیط e3 کشت دادیم .

در TSI که نارنجی رنگ بود از محیط e2 کشت دادیم .

رنگ آمیزی باکتریها : Whole colony : اشکال کلونی : Pnctiform: Circular: ☼☼☼☼☼☼ ЖЖЖЖ Filamentus: ☼☼☼☼☼☼ Rhizoid: ǼĦĦΨΨ Ivregular : ☼☼☼☼☼☼ Flat: Elevation: (شکل جانبی , چقدر بالا رفته) Raised: Convex: Pulvinate: Umbonate: Smooth: صاف Roaph: خشن Drycorn powdery: حالت پودری Sarface appearance: جنس انواع رنگ آمیزی : ساده تفریقی در حالت تفریقی از دو رنگ می توان استفاده نمود که حالت کنتراست داشته باشند .

اما در رنگ آمیزی ساده از یک رنگ استفاده می شود .

هدف ما از رنگ آمیزی تشخیص گران مثبت یا گران منفی بودن باکتری است .

رنگ آمیزی ساده را با متیلن بلو انجام دادیم .

نتایج آزمایش کشت باکتری : کشت در پلیت به صورت کلونی تک دیده می شود .

در مایع کشت بسیار عالی و به رنگ نارنجی در آمده است .

سطح مورب به صورت خوب کشت شده و رنگ آن زرد تیره ( رنگ روغن مایع ) شده است که قبلا قرمز آجری بود .

در SIM مسیر فرو رفتن آنس به صورت ابر مانند می باشد .

Plate : Raised & Circular & Smooth تهیه اسمیر میکروبی و رنگ آمیزی آن : در واقع ما در این تکنیک باکتریهایی را که می خواهیم در زیر میکروسکوپ با اهداف مختلفی بررسی کنیم ابتدا بایستی که یک گسترش را از آنها تهیه کنیم به این صورت که باید یک لایه نازکی از این جمعیت باکتریایی تهیه کنیم بعدا اینها را تثبیت می کنیم روی لام و پس از رنگ آمیزی زیر میکروسکوپ بررسی می کنیم .

برای شروع کار از یک لام تمیز استفاده می کنیم .

ابتدا از آب مقطر یک مقدار بر می داریم خیلی کم روی لام می گذاریم بعد نوک آنس را آغشته می کنیم و در داخل لام کاملا پخش می کنیم بعد در فضای آزمایشگاه باید خشک شده و برای تثبیت از روی شعله رد می کنیم .

تا مدتی که دست را نسوزاند .

مایع را نیز بعد از استریل کردن آنس در محیط مایع فرو می بریم و بعد یک یا دو بار در محیط فرو می بریم و بعد روی لام جدید می ریزیم .

رنگ آمیزی گرم : در روش رنگ آمیزی گرم ما از سه رنگ استفاده می کنیم که 2 تا از این رنگها نقش مستقیم در این رنگ آمیزی دارند و براساس اینکه باکتری ها چه رنگی را به خودشان خواهند گرفت می توان آنها را بعدا دسته بندی کنیم به گرم + و گرم _ ای روش برای اولین بار در سال 1884 توسط کریستین گرند ابدا‌ء شد و به مرور زمان یک سری تغییراتی در آن به وجود آمد ولی به طور کلی اساس کار تفاوت چندانی نمی کرد .

اساس کار: ما ابتدا از یک رنگی استفاده می کنیم بنام رنگ اولیه Primary stain که با این رنگ آمیزی هر دو گروه رنگ خواهند گرفت .

از یک ترکیب رنگ بر استفاده می کنیم ( De colorization agent ) .

رنگی که باعث ایجاد کنتراست می شود .

(Coanterstain) رنگی که باعث ایجاد کنتراست می شود .

(Coanterstain) که در مرحله آخر اجرامی که به وسیله عامل رنگ بر رنگشان را از دست داده اند به این رنگ آغشته می شوند .

رنگ اولیه کریستال ویوله که آبی است .

رنگ بر اتیل الکل 95% است .

رنگ آخر سافرانین یا فوشین است .

(قرمز رنگ).

برای اینکه مراحل از یادمان نرود می توانیم همواره دو کلمه کلاس و کلاف را به خاطر داشته باشیم .

اینکه چرا یکسری از باکتریها رنگ اولیه را به خود جذب می کنند و آن را موقع استفاده از رنگ بر از دست نمی دهند و برعکس یک سری دیگر رنگشان را به راحتی از دست می دهند بنا به یک سری اعتقادات بر می گردد به ترکیب شیمیایی غشاء باکتریها .

ولی شواهدی نیز وجود دارد که ترکیب غشاء نمی تواند چندان در این امر دخیل باشد .

به طور مثال مخمرها که جزء باکتریها اصلا حساب نمی شوند و ساختار دیواره سلولی آنها نیز کاملا متفاوت از باکتریهاست .

ولی در رنگ آمیزی گرم به صورت گرم + دیده می شوند لذا عقیده بر این است که بیشتر منافذی که در غشاء وجود دارند و قابلیت نفوذپذیری این منافذ و یکسری پدیده های فیزیکی در این نحوه رنگ آمیزی دخیل هستند .

در سطح خارجی باکتریهای گرم + قشری از نمک منیزیم ریبونوکلئیک وجود دارد که با رنگ کریستال ویوله و لوگول ترکیب پایدار ایجاد میکند و در اثر مواد بی رنگ کننده نیز این رنگها از باکتری ها خارج نمی شوند و این در حالی است که باکتریهای گرم منفی فاقد این ویژگی هستند .

PH ایزو الکتریکی برای باکتریهای گرم + پایین تر از باکتریهای گرم _ است روی این اصل باکتریهای گرم + در حدود 100 برابر بیشتر از گرم منفی ها کریستال ویوله و ید را جذب می کنند و به راحتی هم این رنگ را از دست می دهند .

گفته می شود که کریستال ویوله و ید در داخل باکتریها با هم ترکیب شده و مولکول درشتی را به وجود می آورند ه این مولکول نمی تواند از جدار گرم + ها خارج شود در حالی که در گرم _ به راحتی می تواند رنگ از طریق دیواره خارج گردد .

بخش اعظم Cell wall گرم _ ها از لیپوپروتئین است و تحت تاثیر ماه رنگ بر الکل و استون چربی های آن حل شده و کمپلکس رنگی خارج می شود .

تذکر مهم : اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر طولانی شود باکتریهای گرم+ به صورت گرم _ دیده خواهند شد .

وهمچنین اگر برای تهیه لام از باکتریهای پیر و مرده استفاده شود که اینها قدرت نگهداری رنگ را ندارد بنابراین به رنگ گرم _ در می آیند .

روش کار: ابتدا یک اسمیر میکروبی تهیه می کنیم ، آن را خشک و بعد Fix می کنیم و بعد آماده می شود برای رنگ کردن .

سطح اسمیر را با کریستال ویوله می پوشانیم یک دقیقه صبر می کنیم .

با یک پیست حاوی آب مقطر اضافی رنگ را می شوییم بعد روی آن لوگول می ریزیم و یک دقیقه صبر می کنیم .

بعد از این کار اضافی این را با آب شستشو می دهیم .

بعد از این مرحله از رنگ بر استفاده می کنیم .

باید دقت شود استفاده از اتیل الکل بیش از حد طولانی نشود .

نهایتا روی آن سافرانین یا فوشین می ریزیم و 45 ثانیه صبر می کنیم و اضافی آنرا می شوییم و خشک می کنیم و با میکروسکوب 100 و روغن ایمرسون بررسی می کنیم .

گرم + به رنگ آبی تا بنفش ( که مال کریستال ویوله است ) گرم _ به رنگ قرمز ( که مال سافرانین یا فوشین می باشد ) کلاس : ک, کریستال ویوله .

ل , لوگول .

ا, اتیل الکل .

س , سافرانین .

کلاف : ‌ ک, کریستال ویوله .

ف , فوشین .

موارد مورد مشاهده شده : سرئوس : باسیل بوده و گرم + می باشد .

اورئوس : کوکسی بوده و گرم + می باشد .

لیسترا مونو سایتراژنز: به شکل باسیل های بسیار کوچک بوده و گرم + می باشد .

ایکولای : به شکل باسیل کوتاه بوده و گرم _ است .

نکته : ما در رنگ آمیزی مرحله آخر از فوشین استفاده کردیم .

پس : اورئوس فقط کوکسی ای کولای فقط گرم _ رنگ آمیزی اسپور : یک سری از باکتریها می توانند ایجاد آندسپور کنند که این آندسپور در مقابل شرایط محیطی می تواند در مقابل خشکی مقاومت زیادی داشته باشد .

از آنجایی که ساختار پوششی اسپور به نحوی است که رنگ در شرایط عادی نمی تواند وارد آن شود بنابراین از یک روش خاصی برای این رنگ آمیزی استفاده می کنیم .

به دین صورت که ما ابتدا از رنگ ( مالاشیت گرین ) سبز مالاشیت و جهت تسهیل ورود این رنگ به داخل اسپور آن را حرارت می دهیم .

حرارت دادن نباید به نحوی باشد که موجب تبخیر و یا جوشیدن رنگمان شود .

برای حرارت دادن می توانیم از هات پلیت استفاده کنیم ولی باید دقت کنیم که حرارت تا حد جوش نرسد .

2 الی 3 دقیقه به آن حرارت می دهیم , بعد خنک می کنیم زیر آب شستشو می دهیم و سپس ب روی آن سافرانین اضافه می کنیم به مدت حدودا 30 تا 40 بعد رنگ اضافه را شستشو می دهیم و بعد خشک می کنیم و با میکروسکوپ 100 بررسی می کنیم .

در این روش رنگ آمیزی اسپورها به رنگ سبز و فرم های دیگر سلول باکتری به رنگ قرمز خواهند شد .

در همان روز محیط SS Agar تهیه کردیم به دین صورت که در داخل200 گرم آب مقطر 12 گرم آگار اضافه کرده و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو می گذاریم .

رنگ آمیزی کپسول : ( رنگ آمیزی منفی ) برای رنگ آمیزی کپسول از Nigrosin استفاده می کنیم .

طریقه درست کردن نیگروزین بدین صورت است که 5/0 گرم از ماده خشک نیگروزین را در 100 سی سی آب مقطر حل می کنیم .

روش کار: یک لام تمیز انتخاب می کنیم در قسمت انتهایی قطره کوچکی از نیگروزین را می گذاریم با استفاده از لوپ ( آنس حلقه ) یک مقدار از کلونی را