دانلود مقاله برهم کنش های سلولی سطح مصنوعی بیومواد خود گرد آور(خود مجتمع)

پیشگفتار یکی از استراتژیهای مهندسی بافت استفاده از سلول های ایزوله شده است که درون ماتریس های سه بعدی رشد کرده و جایگزین ساختار و عملکرد بافت های صدمه دیده یا بیمار می شود.

از آنجا که سلول های دربرگیرنده بافت وابسته به بستر می‌باشند، تنها زمانی می توانند رشد و فعالیت کنند که به سطح مناسب چسبیده باشند.

برخی از متداول ترین مواد مصنوعی که به عنوان ماتریس در ترمیم و بازسازی بافت به کار رفته اند تخریب پذیر هستند مانند پلیمر های زیست سازگاری از قبیل پلی- ال- لاکتیک اسید پلی گلیکولیک اسید و کوپلیمرهای آنها.

خصوصیات مکانیکی نرخ های تخریب و ویژگی های متغیر سطح با کنترل پارامترهای ترکیب طول زنجیر و پردازش مواد قابل دستیابی است.

توانایی کنترل این خصوصیات جزء شرایط مهم مهندسی بافت است زیرا معمولاً اثرات متعاقب مانند چسبندگی رشد و عملکرد سلول را تعیین می کنند.

بررسی شیمی سطح نشان دهنده تاثیر آن بر چسبندگی انواع مختلف سلول های کشت شده (مانند سلول های فیبروبلاست واندوتلیال) است.

مطالعات نشان می دهد که شیمی سطح بر ترکیب، کمیت (اندازه) و ساختار پروتئین های جذب شده بر سطوح مواد اثر می گذارد.

تصور می شود که رونشینی نسبی سرم فیبرونکتین وویترو نکتین در پاسخ به شیمی سطح مسبب چسبندگی اولیه سلول به بستر است.

شیشه سیلانایز و تک لایه های خود مجتمع آلکانتیول ها به عنوان مدل های مطالعه بر هم کنش های خصوصیات بین سطحی مواد رونشینی پروتئین و عکس العمل های سلولی به کار برده می شوند.

متأسفانه این روش ها برای اصلاح سطوح داربست های مهندسی بافت مناسب نیستند.

بیومواد خود مجتمع که ساختارهای تیغه ای یا لایه ای را تشکیل می دهند اجازه کنترل دقیق خصوصیات سطح را داده و یکسان بودن مواد شیمیایی که به طور مکرر در طول زمان در نتیجه تخریب بستر آزاد می شوند را تضمین می کنند.

ملکول های سیستم مدل بررسی شده در اینجا حاوی یک بخش کلسترول و زنجیرهای کوتاه الیگو- ال- لاکتیک اسید هستند که در میان باند استری به طور کووالانت محدود شده اند (گیرافتاده اند).

دلیل انتخاب کلسترول به خاطر خصوصیات ترمو دینامیکی آن برای غشاء های سلول و قابلیت آن در تغییر انتقال (حرکت) غشاء و خصوصیات مکانیکی سلول است.

در حقیقت کلسترول یک جزء اصلی در غشاء سلول های یوکاریوتیک است که قابلیت جفت شدن با سلول ها در همه حالت به طرقی که بابر هم کنش های معمول دریافت کنند (رسپتور) لیگاند متفاوت است را دارد.

دلیل دیگر در انتخاب کلسترول، طبیعت مزوژنی (mesogonic) خوب آن است که به مشتقات آن اجازه تبدیل به حالت سیال بلورین را می دهد.

زنجیرهای الیگومری ال- لاکتیک اسید زیست تخریب پذیر بوده و قابلیت بر هم کنش با ماتریس های معمولی پلی- ال- لاکتیک اسید یا کوپلیمرهای مهندسی بافت را به وسیله بلورینه شدن مشترک (کوکریستالیزاسیون) یا باندهای ثانویه دارند.

در این حالت می توان ازساختارهای خود مجتمع جهت اصلاح سطوح داخلی داربست های سه بعدی ساخته شده از هومو پلیمرها یا کوپلیمرهای لاکتیک اسید و گلیکولیک اسید استفاده کرد.

در این فصل گزارشی از سنتز یکسری از بیومواد خود مجتمع به همراه ویژگی های مولکولی طراحی شده برای بر هم کنش با سلول ها و داربست های بازسازی بافت ارائه می شود.

بیومواد خود مجتمع را می توان به شکل محصولات مناسب با چند پراکنش پائین در حدود 15/1-05/1 سنتز کرد.

این مولکولها ساختارهای لایه ای را ایجاد می‌کند که تحت عنوان فازهای اسمکتیک (بلورینگی) بیان گردیده و قابلیت منظم شدن به شکل توده های تک بلورن با سلول واحد قائم الزاویه ای را دارند.

با قالب گیری بر بسترهای شیشه مشاهده می شود که ساختارهای لایه‏ای، گسترش و چسبندگی فیبروبلاست را افزایش داده و بدین ترتیب به شکل بسترهای زیست فعال رفتار می‌کند.

روش سنتز کردن مشتقات کولستریل- ال- لاکتیک اسید متنوع بوده و برای هر مولکول با عملکرد اسیدی صادق است (قابل استفاده است) نمونه هایی از مشتقات فعال شده عبارتند از مولکول هایی که دارای داروهای ضد تحریک با باندهای کووالانسی همانند اندومتاسین یا کروموفورزهایی مانند رودامین یا پیرین برای تصویر نگاری زیستی هستند.

این فصل همچنین فرایند استفاده از این بیومواد خود مجتمع در اصلاح سطوح داخلی داربست های پلی- ال- لاکتیک اسید که از طریق روش پالایش نمک پردازش می شود را بیان می‌کند.

این روش پوشش می بایست برای همه بیو مواد خود مجتمع کاربرد جامعی داشته باشد.

-مواد MATERIALS -سنتز کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n کلیه بندهای لیست ذیل دارای کیفیت تجاری بوده و از شرکت شیمیایی آلدریچ (میلواکی، ایالت ویسکانسین) به دست آمده اند مگر آنکه ذکر شود.

فلاسک ته گرد شیشه ای خشک شده در کوره تیغه (جدساز) لاستیکی و میله گردان (چرخان) کلسترول باز بلورینه شده از اتانول ال- لاکتید باز بلورینه شده از اتیل استات تری اتیلامین (TEA) نگهداری شده بر روی KOH دی کلرومتان () تازه تقطیر شده از 6-تلوئن تازه تقطیر شده از سدیم- بنزوفنون 7- ، - دی متیل فرمامید (DMF) نگهداری شده بر روی غربال های (صافی های)ملکولی 8-و قطع (II) ­(2- اتیل هگزا نوات) 9- متانول 10- حمام روغن از پیش گرم شده تا دمای و 11- صفحات (ورق) شیشه ای (مرک) mm25/0، با روکش ژل سیلیس 254F 12- ژل سیلیس مرک 60 (mm063/0-040/0، mesh 400-230 ، 60) -سنتز مشتقات کلستریل – (ال- لاکتیک- اسید)n کلستریل- (ال- لاکتیک اسید) n (دی متیل آمینو) پیریدینیوم- 4- تولوئن سولفونات (DPTS) تهیه شده بر طبق دستور فرآیند.

دی ایزوپروپیل کربودیمید (DIPK) 1-(3-دی متیل آمینو پروپیل)- 3- اتیل کربودیمید HCl (EDC) و 4- دیل متیل آمینو پریدین (DMAP) محلول آب نمک و مولکول های زیست عملیاتی: اندومتاسین، رودامین B، 1- پیرنبوتیریک اسید و کلستریل کلروفرمات 4- (ترت- بوتوکسی) بنزوئیک اسید، 4- آمینو بنزوئیک اسید و بنزیل- 4- هیدروکسی بنزوئات pd/C ، سلیت، TEA و محلول -تهیه سطوح شیشه آب خالص شده از طریق عبور از میان سیستم پالایش میلی- کیو‌(مقاومت cm M 2/18) اسید سولفوریک تلغیظ شده و اسید هیدروکلریک تغلیظ شده محلول هیدروکسید آمونیوم تغلیظ شده و 30% هیدروژن پراکسید (حجم 1: 4) تهیه شده در زمان آزمایش درپوش های شیشه ای (به قطر mm22) متناسب با 12 ورقه کشت بافت (کوستار) یا ظروف پتری شیشه ای به قطر cm7/2 باکف صاف (سفارشی) گاز نیتروژن صاف شده با فیلترهای (صافی های) nm22/0 (میلی پور) صافی های حلال سازگار 22/0 (آل تک، دیرفیلد، IL (ایالت ایلینوی) -تولید داربست پلی ال- لاکتیک- اسید، (چند شیوه ای (پلی سانیس) کلروفرم، کلرید سدیم‌ (فیشرساینتفیک، پترزبورگ، پنسیلوانیا) ظروف پیرکس پتری با درپوش های با اندازه mm150-50 (فیشر ساینتفیک) غربال های استاندارد آزمایش در اندازه 500-125 (فیشر ساینتفیک ) منگنه (پانچ) های فولادی استوانه ای (جنرال تولز) پارچه استریل تکز-وایپ (تگز- وایپ) -پوشش دهی داربست روش روکش دهی الف- صافی سلولی 40 (فالکون) ب- ظروف پتری شیشه ای mm50 (فیشرساینتفیک، پترزبورگ، پنسیلوانیا) ج- تایمر (زمان سنج) د- تترا هیدروفوران (فیشر ساینتفیک) -روش ثقلی الف- شبکه نایلونی 40 (فالکون) ب- نگهدارنده داربست: میله چرخشی شیشه ای 40/24 (ایس گلاس) ج- لوله تغذیه (خوراننده): چگالر فروکشنده (reflux Condenser) با یک جا انداز ویگرویکس (سفارش) که به به هم زدن گردش محلول در لوله کمک کرده و پوشش همگن سطح داربست را بهبود می بخشد.

د- منبع ذخیره محلول: قیف جداساز ml25 با جا انداز 20/14 ه- تترا هیدرید فوران (فیشر ساینتفیک) هـ- تترا هیدرید فوران (فیشر ساینتفیک) -کشت سلول فیبروبلاست نوار سلول فیبروبلاست موش6 T3 (96-CCL، مجموعه کشت نوع آمریکایی راک ویل، MD) ماده فیبروبلاست: ماده ایگل اصلاح شده دولبکو (DMEM ، گلوکوز بالا، ال- گلوتامین، mg/l110 سدیم پیرووات، گیبکو- BRL، گراند ایسلند، نیویورک)، سرم جنینی گاو 10% (هی کلون ، لوگان، ایالت یوتا)، پنیسیلین – استر مایسین (گیبکو- BRL) ml/U100-ml/mg100 تریپسین (25/0%) و تریپان بلو (گلیبکو- BRL) هماسایتومتر -روش ها METHODS سنتز کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)n کلید این واکنش ها تحت محیط نیتروژنی انجام می شود.

عمل بسپارس متناسب با طول زنجیر الیگو (ال- لاکتیک اسید) مورد نظر در محلول یا توده تولوئن صورت می گیرد.

-بسپارش محلول Solution polyuerization به عنوان یک مثال معمولی می توان سنتز یک الیگومر با طول نهایی 20 لاکتیک اسید را شرح داد.

همانطور که انتظار می رود برای یک بسپارش «پویا» می توان وزن مولکولی را با کنترل نسبت مولی ال-لاکتید به آغاز کننده کنترل کرده و الیگومرهایی با چند پراکندگی در حدود 1/1 به دست آورد..

این روش بخصوص در سنتز الیگومرهای کلستریل- (ال-لاکتید اسید)n با n بیشتر از 20 ناسب بوده و در اثر ته نشینی ترکیب واکنش در متانول اضافی به راحتی قابل ایزوله کردن (جداسازی) است.

به خاطر قابلیت حل شدگی بالای الیگومرهای با وزن مولکولی پائین تر در متانول، محصولات ایزوله شده در هنگام اعمال این روش برای تهیه الیگومرهای کلستریل- (ال- لاکتیک اسید) با n کمتر از 20 به سرعت کاهش می یابند.

بسپارش آغازین شامل شکل گیری آلومنیوم آلدگساید در اثر اضافه نمودن 1 میزان به 3 میزان کسترول است که در ابتدا تولید می شود.

به طور ویژه M 9/1 محلول تولوئن به ترکیب ال- لاکتید (g65/24 و mmol1/17) و کلسترول در تلوئن (ml120) اضافه می شود.

این ترکیب به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق هم زده می شود و سپس در حمام روغن از پیش گرم شده تا دمای قرار داده می شود.

بعد از 5 ساعت بسپارش توسط MeOH (ml5) سرد می شود.

ترکیب گرم واکنش در MeOH (ml1500) رسوب می‌کند.

مواد جامد پالایش شده (صاف شده) و در دمای اتاق توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول خام را از یک ستون کوتاه (7/7 5: 100 ) می گذرانیم.

محصول نهایی: g8/16 (54%) -بسپارش توده Bulk Polyuenzation سنتز یک الیگومر با طول زنجیره نهایی 10 واحد اسید لاکتیک به عنوان مثال نمونه توضیح داده می شود.

الیگومرهای کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)n با وزن مولکولی کمتر در دمای داخل توده با کاتالیزور قلع II) (2- اتیل هگزانوات) سنتز می شوند.

در زمان نبود الکل به عنوان تطبیق دهنده، کنترل دقیق وزن مولکولی فرایند ممکن نیست.

هر چند در هنگام استفاده از ترکیب تطبیق دهنده الکل با مقدار کاتالیزور الیگومرهایی با وزن مولکولی مشخص (مطابق نسبت مولی ال-لاکتید به آغازگر) قابل تهیه هستند.

انجام بسپارش در توده سبب تسهیل عملکرد شده و محصولات ایزوله شده این زنجیر های کوتاه الیگومری را شدیداً بهبود می بخشد.

با وجود اینکه بسپارش توده ال- لاکتید با کاتالیزور یک فرایند کاملاً «پویا» نیست اما وزن مولکولی آن با تغییر نسبت ال-لاکتید به کلسترول قابل تنظیم بوده و پس از اتمام کار الیگومرهایی با پراکندگی های نسبتاً کم (2/1 ~) به دست می آید.

1- ترکیب ال-لاکتید (g19/10 ، mmol71) و کلسترول (g44/5، mmol14) در یک حمام روغن از پیش گرم شده تا قرار داده شده و تا زمانی که محتویات کاملاً ذوب شوند هم زده می شود.

محلول به تولوئن ml 1 ، ml/ g37/0) اضافه می شود.

ترکیب حاصل از واکنش را به مدت 5 ساعت در دمای به هم می زنیم.

ترکیب واکنش را تا دمای اتاق سرد می کنیم.

ماده جامد باقیمانده را با MeOH (ml100) خرد می کنیم (پودر می کنیم).

مواد جامد را صاف کرده و در دمای اتاق توسط خلاء خشک می کنیم.

محصول نهایی: g82/7 (50%) -سنتز مشتقات کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n مشتقات کلستریل – (ال- لاکتیک اسید)n از طریق استر سازی مستقیم حد نهایی الکل ثانویه (ترکیبی) الیگومر با اسید کربوکسیلیک واحد عملیاتی به دست می آیند.

این ترکیبات در شکل 1-65 نشان داده شده اند.

در حالت کلسترول اندومتازین و پیرین، آنها را ابتدا به بخش پیوند دهنده جفت شده (متصل شده) تا اسیدهای اروماتیک جهت جفت سازی آسان الیگومر از طریق روش DIPC/DPTS شکل گیرند.

-کلستریل- (ال- لاکتیک اسید)n –4-(اندومتازین) بنزوئات به عنوان یک مثال نمونه، مشتق الیگومر کلستریل- (ال –لاکتیک- اسید)34 شرح داده می‏شود.

1-DIPC (ml11/0، mmol 70/0 ) به شکل قطره ای به محلول کلستریل- (ال-لاکتیک اسید)34 (g87/1 ، mmol66%)، (اندومتازین)-بنزوئیک اسید (g 38/0، mmol 80/0) و DPTD (ل20/0 ، mmol 68/0) در (ml10)، اضافه شود.

الف-سنتز 4- (اندومتازین) – بنزولیک اسید (I)- Pd-C (g47/0 ، ، wt 50%) را به محلول بنزیل-4-(اندومتازین)-بنزوئات (g21/1 و mmol 13/2 ) در ترکیب EtAC (ml80) EtOH (ml40) اضافه می کنیم.

(II) مخلوط حاصل را در طول شب تحت محیط خلاء به هم می زنیم.

(III) ترکیب حاصل از واکنش را از طریق مجرای کوچک سلیت صاف می کنیم.

تا خشک شدگی کامل عمل تبخیر را ادامه می دهیم.

ب) سنتز بنزیل-4-(اندومتازین) بنزوئات DIPC (ml 0/1 mmol 40/6) را به محلول اندومتازین (g 0/1،mmol 80/2) ، DPTS (g24/1، mmol21/4) و بنزیل-4-هیدروکسی بنزوئات (g77/0، mmol37/3) پیش در DMF (ml30) اضافه می کنیم.

مخلوط حاصل را در طول شب تحت دمای اتاق به هم می زنیم.

ترکیب حاصل از واکنش را درون آب می ریزیم.

عصاره ترکیب سیال فوق را با (3*) می گیریم.

عصاره را با آب (1*) و آب نمک (1*) می شوییم.

فاز ‎آلی (ارگانیک) را جدا کرده و به وسیله خشک می کنیم.

تا خشک شدگی کامل عمل صاف کردن و