دانلود مقاله میکروسکوپی نیروی اتمی و اسپکتروسکوپی همبستگی فوتون

دو روش برای سرعت بخشیدن به ترسیم لیپوزوم ها چکیده ارزیابی مستقیم ناهه گن تعداد ذرات که سیستم های انتقال داروی نانومتریک هستند ،از جمله : لیپوزوم ها ، به علت اندازه و داشتن حامل بودن ،مشکل است .

تاثیر نسبت و ترکیب لیپودیک برروی استحکام فیزیکی لیپوزوم ها در هنگام نگه داری ازطریق روش میکروسکوپی نیروی اتم (AFM ) و اسکتروسکوپی همبستگی فوتون ( ( PCS مورد بررسی قرار گرفت .

لیپوزوم ها ازترکیب لیپیدهای مختلف ساخته شده و با استفاده از روشهای متفاوت و مجزای آماده سازی به دست می آیند .

تصاویر AFMپس از رسوب گیری نمونه برروی سطح میکابه دست می ایند و آبدانک ها ی کروی شکل می گیرند .

در مدت هفت ماهی که آزمایش انجام شد، میانگین اندازه های لیپوزم های مختلف با استفاده از دو روش قابل مقایسه بودند .

براساس آنالیز PCS ،تصاویرAFM نشان داد که تقریبا سیستم های مختلف آبدانه ای گرایش دارند که در هنگام ذخیره سازی ،توده ها شکل دهند .

با افزایش ارزش شاخص پلی دیس پرسیتی می توان استحکام تضعیف شده را قوی کرد .

حالات متفاوتی که مشاهده می شود ،بیشتر از روشهای آماده سازی لیپوزوم ، به ترکیبات لیپیدی نسبت داده شده اند در نتیجه روش AFM به علت نسبی بودن برای کنترل تکنولوژی میزان پراکندگی و ترسیم فاکتورهای آماده سازی مفید است .

مقدمه : لیپوزوم ها ابدانک کلوئیدی هستند که از طریق هیدارتاسیون قشرهای نازک حشک شکل می گیرند .

فسفولیپید ها به طور معمول برای آماده کردن این سیستم ها استفاده می شوند .

به طوریکه خود به خود د رمحلول آبی انباشته شده و یک یا چندین لیپید دو لایه ای را می سازند که این دو لایه ایی ، هسته آبی را در برمی گیرد .

اکثر اوقات لیپوزوم ها به عنوان یک فرمول استفاده می شود .

بادر نظر گرفتن شیمیایی بودن نسبی آنها از لیپید های بیودگردبل و بیوکوم پتیبل می توان بسیاری از داروها به صورت کپسول در آورده که به همین روش محصولات دیگری از جمله :داروهای نیرو بخش روانی ،داروهای ضد قارچی و ضد سرطانی تولید شده اند .

(گولاتی -1988 .

لیان وهو -2001 ) از اساسی ترین محدودیتهای فرمول لیپوزوم ها ناپایداری آنهاست .

علت ناپایداری شیمیایی آنها به دلیل فرایند ترکیب اکسیژن با اسیدهای چربی اشباع نشده و استربوندهایی است که از طریق آب تجزیه شده اند .

در حالی که ناپایداری فیزیکی این لیپوزوم ها به خاطر نشست دارو و انبوهش ویا پراکندگی آبدانک هاست که ذرات بزرگ رامی سازند این ناپایداری ها بروی حالات بافت زنده ی لیپوزوم ها تاثیر می گذارد .

از این رو نیاز است که قبل از به کار بردن فرمول لیپوزومال برای درمان های دارویی، تحقیقات بسیاری انجام می گیرد .

مواردی چون کوچکی ، تک پاشیدگی و آبدانکهای مقاوم برای آماده سازی بهینه نیاز هستند چرا که غلظت پلاسمهای دارویی لیپوزوم های بزرگ ممکن است به سرعت از طریق سیستم reticulondo the lial (Res) کاهش یابد و در نتیجه این لیپوزوم هاتخلیه شوند مشاهدات ویژگیهای هندسی اندازه و خصوصیات لیپوزوم هادر محیط آبی در کاربرد پتانسیل سیستم ها به عنوان دارو ،از جمله نکاتی هستند که باید به آنها توجه داشت .

از این رو راههاو روش های بسیاری از جمله میکروسکوپی وانواع مختلف اسپکتروپی ها ،به عنوان بهترین ابزار برای توصیف لیپوزوم ها به کار گرفته شده اند .

در طی چند سال گذشته کاربرد AFM در زمینه های بیوتکنولوژی،وسایل نیمه رسانا ،پلیمرها،قشرهای نازک وسطح کانی و همچنین در زمینه بیولوژیکی ودرارو سازی افزایش یافته است .

به عنوان مثال از AFM همواره برای تصویرسازی سطوح باکتریایی (بونارت -2002) ،غلظت پلیمر –دی.

ان.ای (مارتین -2000 ) نانو پارتیکل های چربی جامد (زر محلن -1996 )وتعییرات مورفولوژی لیپوزوم دی.ان.ای .(D.N.A ) استفاده می شود .

AFM یکی از روشهایی است که در خانواده میکروسکوپهای اسکن کننده با قدرت بالایA1 ،این امکان رافراهم میکند که حتی لیپوزومهای بسیارریز رادرمحیط طبیعی ،بدون هیچ دخل وتصرفی در نمونه آن را ببینیم .

به دلیل صراحت نسبی AFM ،از این روش میتوان برای کنترل تکنولوژی میزان پراکندگی استفاده کرد .

هدف این مقاله این است که کاربرد AFM را به منظور توصیف ونگهداری استحکام لیپوزوم های معلق کلوئیدی بالا ببرد وروش AFM را با اسپکتروسکوپی همبستگی موتون مقایسه کند .

همچنین باید در نظرداشت که ترکیبات چربی لیپوزوم می تواند بر روی ساختارهای حمال تأثیربگذارد .به عنوان مثال از چربی ها در قابلیت بار گذاری ،ویژگیهای سلولی و در تقسیم بدنی و لیپوزوم معلق در مقدارهای متفارت استفاده می شود .

دو چربی طبیعی چون فسفاتید کلین و کلسترول و یکی از معروفترین چربی ها که کاتیون فعال دارد dimethy ldioctadecy lammonium bromide میاشد که معمولاً درآماده سازی لیپوزوم ها به عنوان جزء سازنده ی لیپوزمال استفاده می شوند .در اینجا بیشتر ما بر روی استحکام لیپوزونهایی که کاتیون فعال داریم تمرکز کرده ایم،چراکه بیشترین سیستم های لیپوزومی در کاربرد های کلینیکی استفاده میشود .

لیپوزومها کاربرد دارند .

اطلاعات اضافه ی دیگری در مورد ساختار غشاء وویژگیهای سطحی آنها می توان برای توضیح مکانیزم ، کنش متقابل میان چربی ها ومواد ژنیتیکی مفید است .

لیپوزومها به روشهای متفاوتی تولید می شوند ،از جمله : ترکیب ساده آنها با تجزیه وتحلیل چربی ، شستشوی soni cotion به مدت طولانی وهموژنیزه کردن به ویژه با استفاده از روشهای میکروسکوپی الکترون(معمولاً TEM) میتوان میزان پراکندگی وشکل آبدانک ها را به دست آورد.

متاسفانه آبدانک های فسفرلیپید ممکن است براثر دگرگونی ساختار که در نتیجه شرایط خلاء زیاد وپروسه آلودگی اتفاق می افتد ،آسیب ببیند.این نمونه برای مطالعه مواد آلی که باسیستم های زنده ی محلول آبی در ارتباط است ، یک نقص بزرگ محسوب میشود .

در این مقاله ،به بیان اطلاعاتی در مورد ابعاد وهمگنی آبدانک ها که با روش اسپکتروکوپی همبستگی فوتون (PCS )و میکروسکوپی نیروی اتمی (AFM ) به دست آمده ، می پردازیم .

تأثیر ترکیبات لیپوزومال و پروسه آماده سازی برروی استحکام فیزیکی کلوئیدی مورد بررسی قرار گرفت .

پتانسیل زتال ذرات وظیفه دارند که از ذرات در یک محیط خاص استفاده کنند .

اطلاع از پتانسیل زتای آماده سازی لیپوزوم به پیش بینی استحکام و سرنوشت لیوزوم های بافت زنده کمک می کند .

از این رو ، مقدارپراکندگی پلی دیس پرسیتی ها را می توان با استفاده از PCS به دست آورد ، واز طرف دیگر پتانسیل های لیپوزومال های معلق در آب وساکاروز در خصوصیات لیپوزوم هانقش دارند .

2- مواد و روشها 2.1 مواد فسفات کلین زرده تخم مرغ (PC) که فلوکای سوئسی آن را به دست آورد بود وکلسترول (chol ) و(pdab) dime thy ldioctadecy lammonium bromide از شرکت سیگها- آلدریچ (میلان ، ایتالیا ) ودیگر مواد شیمیایی ومواد حلال از منابع استاندارد خود بدون هیچ تصفیه وپالایشی تهیه شده اند .

سیستم آبی Q-MILLI-GL ( مپلی پور- بدفورد – ام .

ای – ایالات متحدآمریکا ) که در آب مقطر استفاده می کند آبی با خالصیت ( M 18) برای استفاده در این آزمایشات فراهم می کند .

2-2 روشها 2.2.1 –آماده سازی لیپوزومها برای آماده کردن لیپوزوم ها از ترکیبات شناخته شده و پروسه ی استاندار استفاده می شود .

به ویژه محلول کلروفوریک کلسترول ،DDAB و PC به مناسبتهای گوناگون در دستگاه تبخیر گردان .تبخیر می شوند تا لایه نازکی بر روی دیواره های اطراف کف با اون شکل بگیرد .

لایه لیپیدیک به مدت سه ساعت در فضای خشک نگه داشته می شود وبه منظور بالا رفتن استحکام لیپوزومال در محلول ساکروز 9% (W,V ) و آب تصفیه شده معلق می ماند .

سرانجام کیسلو (2003 ) ثابت کرد که آبدانک های (DPMC ) lcholine Dimyris t Oylphos phatidy که در محلول آبی ساکاروز 15% - 5 آماده میشوند به مدت 32 روز استحکام بهتری دارند .

Dimyris t Oylphos phatidy که در محلول آبی ساکاروز 15% - 5 آماده میشوند به مدت 32 روز استحکام بهتری دارند .

وهمچنین تحقیقات نشان داده است که استفاده از محلول ساکاروز ، از رخنه کردن دارو در میان لیپوزومال های دولایه ایی جلوگیری وآبدانک ها در طول پروسه ی خشک شدن با یکدیگر ترکیب می شوند (کرو 1997 ) لیپوزوم های تک لایه ای کوچک از طریق سه پروسه به دست می آیند : از طریق شستشوی sonication ( برلین –آلمان ) به مدت یک ساعت .

از طریق هموژنیزه کردن به مدت هفت دقیقه در درجه حرارت 500/20 (آلتراتوراکس 125 ، لابراتور فنی کن کل کان – آلمان ) .

ودو مرتبه از طریق شستوشوی sonication به مدت ده دقیقه ویا از طریق گردابی(z*3velp ) به مدت پنج دقیقه وسپس شستوشوی sonication به مدت ده دقیقه .

لیپوزوم های به دست آمده با عبور کردن از منفذه های 0.2 میلی متری غشا ptfe ،تصفیه می شوند .

آماده سازی پارامترهای فرمول لیپوزوم کلوئیدی جدول(1) روش آماده سازی (نسبتها) ترکیبات نمونه برای کنترل استحکام نمونه .

آماده سازی در دمای اتاق ویادر دمایc4 به دوراز نور انجام میگردد 2.2.2- آنالیز اسکتروسکوپی همبستگی فوتون از PCS برای مشخص کردن اندازه ی آبدانک ها استفاده می کنند .( زتامستر، ابزارمال ورن ) .در آزمایشاتی که انجام شد از لیرز به عنوان منبع نوری استفاده شد .

این لیزرکه لیرز 4.5MW نامیده میشود،خروجی با قدرت بالا ی 640nm در5mw دارد .

اندازه گیری های pcs در زاویه ی 90 را نشان داده شده اند .

کار کرد همبستگی از طریق آنالیزاتور ذرات میکروسکوپی pcs مال ورن انجام شد واز ترکیب مناسب سه راسته .

(چو-1974 .

برن وبکورا – 1976 ) میانگین قطر وپلی دیس پرسیتی به دست می آید .

انکساری واقعی دغیر واقعی شاخص از 5.5 تا 1059 در نظر گرفته می شود .

نمونه ها در محلولهای ساکروز 9% (w/v ) وآب تصفیه شده رقیق می شوند (1:100 ).

آزمایشات تکراری برروی نمونه انجام میشود و برای هر آزمایش سی اندازه گیری انجام می شود و اطلاعات بر اساس میانگین+ انحراف معیار بیان می شود .

2.2.3- تصویر سازی میکروسکوپی نیروی اتمی "پارک آتوپ روب " انجام شد .

تصاویر AFM از طریق اندازه گیری کنش متقابل نیروهای بین نوک وسطح نمونه به دست آمده است .(یالامانچیلی -1998 ) .آزمایشات در دمای اتاق ،در زیر آب انجام می شود (C20 ( ودر فشار اتمسفری (mmhg 760 ) به شیوه ی بدون تماس (NC-AFM) انجام گرفت به صورتیکه فضای بین نوک ونمونه از 10 تاA 100 ونیروی کلی بسیار کم است .

این نیروی کم ، برای مطالعه وبررسی نمونه هالزم و شکل پذیر مناسب است .

نوکهای سیلیکون مثلثی شکل برای این آنالیز استفاده می شود .فرکانس تشدید کننده ی این کانتیلور در حدود KHZ300 .

به منظور ترسیم لیپوزوم ها ، روش بدون تماس مناسب تر است چرا که آبدانک ها ،آمادگی کمی برای بار کردن نیروهای اعمال شده دارند.

قبل از آنالیز ، نمونه ها در آب رقیق می شوند .

(1:100 ) تا کمی شاره چسبناک برای تجزیه و تحلیل به دست آورند .

حجم ثابت قطره های ریز (40mm ) می باشد که بر روی صفحه کوچک میکا تا قطر 1cm ته نشین می شود .

بعد از دو دقیقه برای انتقال دادن آب اضافه از برگه های فیلتر استفاده می کنیم دو نوع تصویر به دست می آید : تصویر اولی تصویر توپوگرافی است و تصویر دومی گه "سیگنال اشتباه " را نشان می دهد این سیگنال اشتباه از طریق مقایسه دو سیگنال به دست آمده اند سیگنال اول ، دامنه ارتعاشات پایه و ئیگر نقطه مبدأ دامنه را نشان می دهد .

تصاویری که از این روش به دست می آید تغییرات سطحی نمونه ها را نشان می دهد اندازه لیپوزوم ها در تصاویری مجزا در خطهای قرار دادی که آبدانک ها ی کوچک را قطع می کند نشان داده شده است برای اندازه گیری بعد لیپوزوم ها ما یک خط را انتخاب کرده و موقعیت هر لیپوزوم را در دو طرف آن محدود می کنیم تمام اطلاعات میانگین اندازه گیری ها در هر آزمایش نشان می دهد .

4 .

2 .

2 – اندازه گیری پتانسیل الکترونیکی : به منظور بررسی ویژگی های سطحی لیپوزوم ها از آنالیزاتور الکتروفورسیس ذرات زتامستر که مجهز به لیزر 5Mw he-Ne است برای اندازه گیری جنبش الکترونیکی و پراکندگی پتانسیل زتا استفاده می کنند .(ابزار مال ورن ) زتا گسترده حدود تغییرات را در v120 تا 120 – محدود می کند .

پارامترهای استروبینگ در مجموعه های زیر قرار می گیرند : تاخیر استروب oo10 – 0 زمان روشن ms 20000 .

زمان خاموش ms oo.1 .

با استفاده از یک smoluchowslcy ثابت 1.5 از (ka)F مقدار پتانسیل زتا را از جنبش الکتروفورتیک به دست می آوریم .

برای این آنالیز ، نمونه در محلول ساکروز و آب تصفیه شده رقیق می شود (100 : 1( ده اندازه گیری مختلف برای هر نمونه انجام می شود .

3- نتایج و مذاکره 3.1 – آنالیز PCS آنالیز PCS لیپوزوم