دانلود تحقیق روشهای بیوتکنولوژی اصلاح گیاهان دارویی

روشهای بیوتکنولوژی اصلاح گیاهان دارویی
مقدمه
اگرچه کاشت گیاهان دارویی به هزاران سال پیش باز می‌گردد ولی باید گفت که در مورد اصلاح آنها تاکنون پیشرفت قابل ملاحظه‌ای صورت نگرفته است و در حال حاضر، تعداد کالتیوارهای مفید به‌دست آمده بر اثر اصلاح گیاهان دارویی اندک است.

هدف از اصلاح گیاهان دارویی، افزایش کمیت و کیفیت آن دسته از مواد مؤثره در این گیاهان است که در صنایع دارویی از اهمیت خاصی برخوردار هستند.

در سال‌های اخیر توجه خاصی از جانب سازمان‌های مختلف در کشورهای جهان در ارتباط با اصلاح این گیاهان صورت گرفته است.

در این راستا استفاده از تکنیکهای وابسته به کشت بافت و بیوتکنولوژی به منظور ارتقاء صفات کمی و کیفی و کاهش زمان اصلاح نباتات از اهمیت خاصی برخوردار است.

کشت بافت
با تکنیک کشت بافت می توان از یک سلول به یک گیاه کامل دست یافت.

در این تکنیک از روشهای جنین زایی ریزازدیادی و اندام زایی استفاده میگردد.استفاده از این تکنیک به همراه موتاسیون باعث سرعت بخشیدن به تکثیر انبوه تولید گیاهان عاری از بیماری انجام کار در تمام طول سال و کاهش هزینه خواهد شد.

اولین مرحله تکثیر قسمت مورد نظر در گیاه می باشد.پس از تعیین دز مناسب و انجام تیمار پرتوتابی و تکثیر دوباره گزینش درشرایط In-vitro با اعمال تیمار تنش صورت میگیرد .گیاهان گزینش شده بعد از انتقال به گلدان جهت سازگاری و تکثیر دوباره جهت سلکسیون انتهایی در مزرعه کشت شده و سپس مورد بررسی های تغییرات زنتیکی قرار خواهند گرفت.

یکی از بخش‌های مهم بیوتکنولوژی “کشت بافت” است که کاربردهای مختلف آن در زمینه گیاهان دارویی، از جنبه‌های مختلفی قابل بررسی است:
باززایی در شرایط آزمایشگاهی ( In-Vitro Regeneration )
تکثیر گیاهان در شرایط آزمایشگاهی، روشی بسیار مفید جهت تولید داروهای گیاهی باکیفیت است.

روش‌های مختلفی برای تکثیر در آزمایشگاه وجود دارد که از جمله ‌ آنها، ریزازدیادی است.

ریزازدیادی فواید زیادی نسبت به روش‌های سنتی تکثیر دارد.

با ریزازدیادی می‌توان نرخ تکثیر را بالا برد و مواد گیاهی عاری از پاتوژن تولید کرد.

گزارش‌های زیادی در ارتباط با بکارگیری تکنیک ” کشت بافت ” جهت تکثیر گیاهان دارویی وجود دارد.

با این روش برای ایجاد کلون‌های گیاهی از تیره لاله در مدت 120 روز بیش از 400 گیاه کوچک همگن و یک شکل گرفته شد که 90 درصد آنها به رشد معمولی خود ادامه دادند.

برای اصلاح گل انگشتانه، از نظر صفات ساختاری، مقدار بیوماس، میزان مواد مؤثره و غیره با مشکلات زیادی مواجه خواهیم شد ولی با تکثیر رویشی این گیاه از راه کشت بافت و سلول، می‌توان بر آن مشکلات غلبه نمود.

چنان‌که مؤسسه گیاهان دارویی بوداکالاز در مجارستان از راه کشت بافت و سلول گل انگشتانه موسوم به آکسفورد، توانست پایه‌هایی کاملاٌ همگن و یک شکل از گیاه مذکور به‌دست آورد.

باززایی از طریق جنین‌‌زایی سوماتیک (غیرجنسی)
تولید و توسعه مؤثر جنین‌های سوماتیک، پیش‌نیازی برای تولید گیاهان در سطح تجاری است.

جنین‌زایی سوماتیک فرآیندی است که طی آن گروهی از سلول‌ها یا بافت‌های سوماتیک، جنین‌های سوماتیک تشکیل می‌دهند.

این جنین‌ها شبیه جنین‌های زیگوتی (جنین‌های حاصل از لقاح جنسی) هستند و در محیط کشت مناسب می‌توانند به نهال تبدیل شوند.

باززایی گیاهان با استفاده از جنین‌زایی سوماتیک از یک سلول، در بسیاری از گونه‌های گیاهان دارویی به اثبات رسیده است.

بنابراین در این حالت با توجه به پتانسیل متفاوت سلول‌های مختلف در تولید یک ترکیب دارویی، می‌توان گیاهانی با ویژگی برتر نسبت به گیاه اولیه تولید نمود.

حفاظت گونه‌های گیاهان دارویی از طریق نگهداری در سرما
با تکیه بر کشت بافت و سلول می‌توان برای نگهداری کالتیوارهای مورد نظر در بانک ژن یا برای نگهداری طولانی مدت اندام‌های تکثیر گیاه در محیط نیتروژن مایع، اقدام نمود.

نگهداری در سرما، یک تکنیک مفید جهت حفاظت از کشت‌های سلولی در شرایط آزمایشگاهی است.

در این روش با استفاده از نیتروژن مایع (196- درجه سانتی‌گراد) فرآیند تقسیم سلولی و سایر فرآیندهای متابولیکی و بیوشیمیایی متوقف شده و در نتیجه می‌توان بافت یا سلول گیاهی را مدت زمان بیشتری نگهداری و حفظ نمود.

با توجه به اینکه می‌توان از کشت‌های نگهداری شده در سرما، گیاه کامل باززایی کرد، لذا این تکنیک می‌تواند روشی مفید جهت حفاظت از گیاهان دارویی در معرض انقراض باشد.

مثلاً بر اساس گزارشات منتشر شده، روش نگهداری در سرما، روشی مؤثر جهت نگهداری کشت‌های سلولی گیاهان دارویی تولیدکننده آلکالوئید همچون Rauvollfia serpentine , D.

lanalta , A.

belladonna , Hyoscyamus spp .

است.

این تکنیک، می‌تواند جهت نگهداری طیفی از بافت‌های گیاهی چون مریستم‌ها، بساک و دانه گرده، جنین، کالوس و پروتوپلاست به‌کار رود.

تنها محدودیت این روش، مشکل دسترسی به نیتروژن مایع است.

تولید متابولیت‌های ثانویه از گیاهان دارویی
از لحاظ تاریخی، اگرچه تکنیک ” کشت بافت ” برای اولین بار، در سال‌های 1940-1939 در مورد گیاهان به‌کار گرفته‌شد، ولی در سال 1956 بود که یک شرکت دارویی در کشور آمریکا ( Pfizer Inc ) اولین پتنت را در مورد تولید متابولیت‌ها با استفاده از کشت توده‌ای سلول‌ها منتشر کرد.

کول و استابو (1967) و هبل و همکاران (توانستند مقادیر بیشتری از ترکیبات ویسناجین ( Visnagin ) و دیوسجنین ( Diosgenin ) را با استفاده از کشت بافت نسبت به حالت طبیعی (استخراج از گیاه کامل) به‌‌دست آورند.

گیاهان، منبع بسیاری از مواد شیمیایی هستند که به‌عنوان ترکیب دارویی مصرف می‌شوند.

فرآورده‌های حاصل از متابولیسم ثانویه گیاهی ( Secondary Metabolite ) جزو گرانبهاترین ترکیب شیمیایی گیاهی ( Phytochemical ) هستند.

با استفاد از کشت بافت می‌توان متابولیت‌های ثانویه را در شرایط آزمایشگاهی تولید نمود.

لازم به‌ذکر است که متابولیت‌های ثانویه، دسته‌ای از مواد شامل اسیدهای پیچیده، لاکتون‌ها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها هستند که به‌صورت عصاره یا پودرهای گیاهی در درمان بسیاری از بیماری‌های شایع به‌کار برده می‌شوند.

راهکارهای افزایش متابولیت‌های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت
1- استفاده از محرک‌های ( Elicitors ) زنده و غیر زنده‌ای که می‌توانند مسیرهای متابولیکی سنتز متابولیت‌های ثانویه را تحت تأثیر قرار داده و میزان تولید آنها را افزایش دهند.

لازم به‌ذکر است که این محرک‌ها در شرایط طبیعی نیز بر گیاه تأثیر گذاشته و باعث تولید یک متابولیت خاص می‌شوند.

2- افزودن ترکیب اولیه ( Precursor ) مناسب به محیط‌کشت، با این دیدگاه که تولید محصول نهایی در نتیجه وجود این ترکیبات در محیط‌کشت، القاء شود.

3- افزایش تولید یک متابولیت ثانویه در اثر ایجاد ژنوتیپ‌های جدیدی که از طریق امتزاج پروتوپلاست یا مهندسی ژنتیک، به‌دست می‌آیند.

4- استفاده از مواد موتاژن جهت ایجاد واریته‌های پربازده 5- کشت بافت ریشه گیاهان دارویی (ریشه، نسبت به بافت‌های گیاهی دیگر، پتانسیل بیشتری جهت تولید متابولیت‌های ثانویه دارد) مثال‌های قابل ذکر آنقدر زیاد است که تصور می‌شود هر ماده‌ای با منشاء گیاهی، از جمله، متابولیت‌های ثانویه را می‌توان به‌وسیله کشت‌های سلولی تولید کرد: از جمله ترکیباتی که از طریق کشت سلولی و کشت بافت به تولید انبوه رسیده است،‌ داروی ضد سرطان تاکسول است.

این دارو که در درمان سرطان‌های سینه و تخمدان به‌کار می‌رود از پوست تنه درخت سرخدار ( Taxus brevilifolia L.

) استخراج می‌گردد.

از آنجایی‌که تولید تاکسول به‌دلیل وجود 10 هسته استروئیدی در ساختار شیمیایی آن بسیار مشکل است و جمعیت طبیعی درختان سرخدار نیز برای استخراج این ماده بسیار اندک است، لذا راهکار دیگری را برای تولید تاکسول باید به‌کار گرفت.

در حال حاضر، برای تولید تاکسول از تکنیک کشت بافت و کشت قارچ‌هایی که بر روی درخت رشد کرده و تاکسول تولید می‌کنند،‌ استفاده می‌گردد.

سولاسودین ( Solasodine ) نیز از ترکیبات دیگری است که از طریق کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Solanum eleganifoliu به‌دست می‌آید.

از جمله متابولیت‌های دیگری که از طریق تکنیک کشت بافت و در مقیاس تجاری تولید می‌شود، شیکونین ( Shikonin ) (رنگی با خاصیت ضد حساسیت و ضد باکتری) است.

مثال‌های زیر گویای کارایی تکنیک کشت بافت در تولید متابولیت‌های ثانویه است.

تولید آلکالوئید پیرولیزیدین ( Pyrolizidine ) از کشت بافت ریشه Senecio sp ، سفالین ( Cephaelin ) و امتین ( Emetine ) از کشت کالوس Cephaelis ipecacuanha ، آلکالوئید کوئینولین ( Quinoline ) از کشت سوسپانسیون سلولی Cinchona ledgerione و افزایش بیوسنتز آلکالوئیدهای ایندولی با استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Catharanthus roseus .

استفاده از بیورآکتورها در تولید صنعتی متابولیت‌های ثانویه تولید متابولیت ثانویه گیاهی با خصوصیات دارویی در شرایط آزمایشگاهی، فواید زیادی در مقایسه با استخراج این ترکیبات از گیاهان، تحت شرایط طبیعی دارد.

کنترل دقیق پارامترهای مختلف، سبب می‌شود که کیفیت مواد حاصل در طول زمان تغییر نکند.

درحالی که در شرایط طبیعی مرتباٌ تحت تأثیر شرایط آب و هوایی و آفات است.

تحقیقات زیادی در زمینه استفاده از کشت‌های سوسپانسیون و سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ثانویه صورت گرفته است.

از جمله ابزارهایی که برای کشت وسیع سلول‌های گیاهی به‌کار رفته‌اند، بیورآکتورها هستند.

بیورآکتورها، مهمترین ابزار در تولید تجاری متابولیت‌های ثانویه از طریق روش‌های بیوتکنولوژیک، محسوب می‌شوند.

مزایای استفاده از بیورآکتورها در کشت انبوه سلول‌های گیاهی عبارتند از: 1- کنترل بهتر و دقیق‌تر شرایط خاص مورد نیاز برای تولید صنعتی ترکیبات فعال زیستی از طریق کشت سوسپانسیون سلولی 2- امکان تثبیت شرایط در طول مراحل مختلف کشت سلولی در بیورآکتور 3- جابجایی و حمل‌ونقل آسان‌تر کشت (مثلاً، برداشتن مایه‌کوبه در این حالت راحت است) 4- با توجه به اینکه در شرایط کشت سوسپانسیون، جذب مواد غذایی به‌وسیله سلول‌ها افزایش می‌یابد، لذا نرخ تکثیر سلول‌ها زیاد شده و به‌تبع آن میزان محصول (ترکیب فعال زیستی) بیشتر می‌شود.

5- در این حال، گیاهچه‌ها به آسانی تولید و ازدیاد می‌شوند.

سیستم بیورآکتور برای کشت‌های جنین‌زا و ارگانزای چندین گونه گیاهی به‌کار رفته است که از آن‌جمله می‌توان به تولید مقادیر زیادی سانگئینارین ( sanguinarine ) از کشت سوسپانسیون سلولی Papaver somniferum با استفاده از بیورآکتور، اشاره کرد.

با توجه به اینکه بیورآکتورها، شرایط بهینه را برای تولید متابولیت‌های ثانویه از سلول‌های گیاهی فراهم می‌آورند، لذا تغییرات زیادی در جهت بهینه‌سازی این سیستم‌ها، برای تولید مواد با ارزش دارویی (با منشأ گیاهی) همچون جینسنوساید ( ginsenoside ) و شیکونین صورت گرفته است.

نشانگرهای مولکولی بخش مهم بعدی دارای کاربرد فراوان در حوزه گیاهان دارویی، “نشانگرهای مولکولی” است.

قبل از اینکه به موارد کاربرد نشانگرهای مولکولی پرداخته شود، لازم است دلایل لزوم استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی ذکر شود: دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی فاکتورهایی همچون خاک و‌ شرایط آب و هوایی، بقای یک گونه خاص و همچنین محتوای ترکیب دارویی این گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهند.

در چنین حالاتی علاوه بر اینکه بین ژنوتیپ‌های مختلف یک گونه تفاوت دیده می‌شود از لحاظ ترکیب دارویی فعال نیز با هم فرق می‌کنند.

در هنگام استفاده تجاری، از این گیاه دو فاکتور، کیفیت نهایی داروی استحصالی از این گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهند: 1- تغییر محتوای یک ترکیب دارویی خاص در گیاه مورد نظر 2- اشتباه گرفتن یک ترکیب دارویی خاص با اثر کمتر که از گیاهان دیگر به‌دست آمده است.

به‌جای ترکیب دارویی اصلی که از گیاه اصلی به‌دست می‌آید.

چنین تفاوت‌هایی، مشکلات زیادی را در تعیین و تشخیص گیاهان دارویی خاص، با استفاده از روش‌های سنتی (مرفولوژیکی و میکروسکوپی)، به‌دنبال خواهد داشت.

برای روشن‌شدن موضوع به مثال زیر توجه کنید: کوئینون یک ترکیب دارویی است که از پوست درخت سینکونا ( cinchona ) به‌دست می‌آید.

پوست درختان سینکونا که در جلگه‌ها کشت شده‌اند، حاوی کوئیونی است که از لحاظ دارویی فعال است.

گونه‌های مشابهی از این درخت وجود دارند که به‌روی تپه‌ها و زمین‌های شیبدار رشد می‌کنند و از لحاظ مرفولوژیکی (شکل ظاهری) مشابه گونه‌هایی هستند که در جلگه‌ها رشد می‌کنند، اما در این گونه‌ها کوئیون فعال وجود ندارد.

در طول دهه‌های گذشته، ابزارهایی که برای استانداردسازی داروهای گیاهی به‌وجود آمده‌اند، شامل ارزیابی ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک و همچنین تعیین نیمرخ شیمیایی ( Chemoprofiling ) مواد گیاهی بوده‌اند.

قابل ذکر است که نیمرخ شیمیایی، الگوی شیمیایی ویژه‌ای برای یک گیاه است که از تجزیه عصاره‌ آن گیاه به‌وسیله تکنیک‌هایی چون TLC و HPTLC و HPLC به‌دست آمده است.

ارزیابی ماکروسکوپیک مواد گیاهی نیز بر اساس پارامترهایی چون شکل، اندازه، رنگ، بافت،‌ خصوصیات سطح گیاه، مزه و غیره صورت می‌گیرد.

علاوه بر این، بسیاری از تکنیک‌های آنالیز، همچون آنالیز حجمی ( Volumetric Analysis )، کروماتوگرافی گازی (Gas Chromatography )، کروماتوگرافی ستونی ( Column Chromatography ) و روش‌های اسپکتروفتومتریک نیز برای کنترل کیفی و استانداردسازی مواد دارویی گیاهی، مورد استفاده قرار می‌گیرند.

گرچه در روش‌های فوق، اطلاعات زیادی در مورد یک گیاه دارویی و ترکیبات دارویی موجود در آن فراهم آید، ولی مشکلات زیادی نیز به‌همراه دارد.

مثلاً برای اینکه یک ترکیب شیمیایی به‌عنوان یک نشانگر ( Marker ) جهت شناسایی یک گیاه دارویی خاص، مورد استفاده قرار گیرد، باید مختص همان‌گونه گیاهی خاص باشد، در حالی‌که همه گیاهان دارویی، دارای یک ترکیب شیمیایی منحصربه‌فرد نیستند.

همچنین بین بسیاری از مولکول‌های شیمیایی که به‌عنوان نشانگر و یا ترکیب دارویی خاص مدنظر هستند، هم‌پوشانی معنی‌داری وجود دارد؛ این موضوع در مورد ترکیبات فنولی و استرولی حادتر