چکیده
پیش‌آگاهی از وقوع بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از Septoria tritici در تنظیم و طراحی دقیق مبارزه شیمیایی بسیار حائز اهمیت است.
یکی از روشهای شناسایی این بیماری پیش از بروز علایم، استفاده از فن‌آوری ایمنی‌سنجی است.
در این تحقیق اهمیت بهره‌گیری از این فن‌آوری در تعیین نوع، مقدار مصرف قارچکش و زمان سمپاشی مورد بررسی قرار گرفته است.
برای این منظور در 44 ظرف کاشت، گندم رقم روشن کاشته شد.
گیاهچه‌ها در مرحله 12 روزگی با سوسپانسیونی از اسپوریدی‌های قارچ مایه زنی شدند.
20 ظرف کاشت پیش از بروز علایم بیماری و 20 ظرف دیگر پس از بروز آن با سه میزان 2، 1 و 5/0 درهزار از قارچکش‌های پروپیکونازول و سایپروکونازول با سه تکرار سمپاشی شدند.
چهار ظرف کاشت باقیمانده در هر دسته نیز بعنوان شاهد با آب معمولی تیمار گردید.
این طرح بصورت طرح فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی به اجرا درآمد.
چگالی نوری نمونه‌های برگی پس از عصاره گیری و انجام آزمون الایزا تعیین و به مقادیر واحدهای پادگنی قارچ تبدیل شده و تاثیر هر یک از تیمارها بر این مقادیر مورد مقایسه قرار گرفت.
نتایج نشان داد که بین مقادیر درصد کاهش واحدهای پادگنی در صورت اعمال سمپاشی پیش و پس از بروز علایم اختلاف معنی داری وجود دارد.
همچنین درصورت استفاده از قارچکش پروپیکونازول و سایپروکونازول با پیش‌آگاهی بیماری میتوان میزان سمپاشی و در نتیجه هزینه سمپاشی با هر دو قارچکش را تا 4 برابر کاهش داد.
اختلاف معنی داری بین درصد کاهش واحدهای پادگنی در دو قارچکش سایپروکونازول و پروپیکونازول دیده نشد.
استفاده از این فن‌آوری علاوه بر تعیین زمان دقیق اعمال تیمارها، به کاهش قابل توجه میزان سمپاشی با قارچکش‌ها و تأثیر هرچه بیشتر آنها خواهد انجامید.
کلمات کلیدی : بلاچ برگی گندم، Septoria tritici، مبارزه شیمیایی، داس الایزا، پیش آگاهی، پروپیکونازول، سایپروکونازول، تشخیص پیش از بروز علایم
مقدمه
یکی از تهدیدهای عمده گندم‌کاری در کشور، شیوع و گسترش فزاینده بیماری بلاچ برگی گندم ناشی از S.
tritici است (1و2).
دلایل عمده افزایش این بیماری، رواج کاشت ارقام گندم مقاوم به زنگها و سفیدک پودری ولی حساس به بیماریهای سپتوریایی، از بین نبردن بقایای گیاهی، افزایش مصرف کودهای ازته و مقاومت عوامل بیماریزا به قارچکش‌ها عنوان شده است (7و8و10).
یکی از جنبه‌های حفاظت گیاهان از آسیب عوامل بیماریزا، پیش‌آگاهی و تشخیص آلودگی و عامل بیماریزا پیش از بروز علایم است.
اینکار، درواقع به تصمیم‌گیری در انتخاب نوع قارچکش، زمان و تعداد سمپاشی‌ها کمک خواهد نمود.
بعبارت دیگر، استفاده از این روش که جهت سنجش آستانه بیماری انجام می‌گیرد، در راستای کاربرد بهینه قارچکش ها براساس مدیریت تلفیقی آفات از اهمیت زیادی برخوردار می‌باشد (6).
علی‌رغم وجود گندم‌هایی حامل ژنهای مقاومت به بیماری سپتوریوز برگی، هنوز کنترل این بیماری با استفاده از قارچکش‌ها انجام میشود و در این راستا، قارچکش‌های تریازولی عملاً نتایج موفقیت‌آمیزی درپی‌داشته‌اند.
انتخاب نوع و مقدار سم بکار گرفته شده در هر مزرعه برحسب شرایط اقلیمی، رقم و مرحله رشدی محصول متفاوت خواهد بود (10).
از نقطه نظر همه‌گیری‌شناسی بیماری، مرحله‌ای از رشد میزبان که تعیین کننده اِعمال تیمارهای معالجه‌ای علیه این بیماری است، زمان مشخصی نداشته و از این لحاظ اقدام ناآگاهانه به سمپاشی نیز موفقیت اتفاقی و ناپایدار خواهد داشت (7).
در مراحل اولیه آلوده شدن گیاه، علایم دقیقی حاکی از بروز این بیماری در گیاه قابل رؤیت نیست.
از طرفی، تأثیر حتی مؤثرترین سم تریازولی نیز به دوره گسترش هیف S.
tritici در بافت میزبان (14 الی 21 روز) محدود میشود.
بعبارت دیگر پس از پیدایش پیکنیدها در سطح برگ هیچ یک از سموم تریازولی موجود تأثیر چندانی در کنترل بیماری ندارد (9).
ازاینرو، شناسایی بیماری سپتوریوز در گیاه پیش از بروز علایم و پیدایش پیکنیدها اهمیت بسیاری دارد، چرا که به انتخاب زمان دقیق سمپاشی، نوع و مقدار مناسب قارچکش مورد استفاده، کمک نموده و کنترل بهتر بیماری را درپی‌خواهد داشت (9).
یکی از رایج‌ترین فن‌آوری‌ها در تشخیص این بیماری پیش از بروز علایم، روش داس‌الایزا1 می‌باشد که اساس کار آن اتصال آنتی‌بادی ویژه به آنتی‌ژن خود بصورت پایدار و کاملاً اختصاصی است (12،14).
این روش اکثراً در تشخیص بیماری‌هایی که دوره نهفتگی طولانی‌تری دارند، بکار می‌رود (3،14).
با استفاده از این روش، عامل بیماری حتی در هنگامیکه اولین سلولهای آن شروع به رخنه در گیاه می‌کنند، قابل شناسایی و سنجش است.
در این روش از پادتن‌های فوق العاده اختصاصی استفاده میشود که محلهای پروتئین خارج سلولی عامل بیماریزا را شناسایی می‌کنند.
واکنش بین پادگن و پادتن بسیارحساس و اختصاصی بوده و نتیجه آن به رقم و مرحله رشدی میزبان، محل قرارگیری و سن برگ، سمپاشی‌های قبلی و شرایط محیطی بستگی ندارد (12).
برای نخستین بار در سال 1988 شرکت کشاورزی سیبا1 اقدام به تولید پادتن برای S.
tritici و Stagonospora nodorum نموده و آن را ساعت سپتوریای2 نامید (3 و12).
در سال 1989 شرکت نوارتیس، برنامه پیش آگاهی سپتوتست3 را بعنوان ابزاری پیشرفته و مدرن جهت شناسایی دقیق بیماریهای سپتوریایی در گندم طراحی و ارائه نمود که در حال حاضر در کشورهایی نظیر انگلستان، فرانسه، آلمان، سوئد و ایالات متحده رواج یافته است.
همچنین سیستم پیش‌آگاهی دیگری در فرانسه بنام پرسپت4 نیز به همین منظور بوجود آمده است (3).
شرکتهای تولید کننده مواد شیمیایی کشاورزی مثل سیبا، نوارتیس5 و دوپان6 نیز فعالیتهای گسترده‌ای را درخصوص تشخیص مولکولی بیماریهای مهم ازجمله بیماری سپتوریوز گندم آغاز نموده‌اند (5و6).
هدف از این آزمایش ارزیابی روش ایمنی سنجی جهت استفاده بهینه از آفتکش‌های پروپیکونازول و سایپروکونازول در مبارزه با بلاچ برگی گندم می‌باشد.
مواد و روش ها
این تحقیق در گلخانه تحقیقاتی دانشگاه فردوسی مشهد و در سال 1379 انجام شد.
آزمایش در قالب طرح فاکتوریل 2×2×4 با سه تکرار و طرح پایه کاملاً تصادفی در شرایط گلخانه به اجرا درآمد.
در 44 ظرف کاشت چوبی به ابعاد تقریبی 25 × 50 و عمق 15 سانتیمتر محتوی نسبت مساوی از خاک بکر و کود حیوانی، بذر گندم رقم روشن در دو ردیف به فاصله 15 سانتیمتر از هم و در هر ردیف تعداد 10 بذر در فواصل 5 سانتیمتری بدون ضدعفونی کاشته شدند.
جدایه قارچی F17 از مزارع گندم اطراف شهرستان فردوس از برگهای مبتلا به بلاچ برگی گندم جداسازی و S.
tritici تشخیص داده شد (10).
مایه آلودگی قارچ از محیط کشت مایع سوکروز - مخمر (سوکروز 10 گرم، عصاره مخمر10 گرم و آب مقطر1000 میلی لیتر) که بمدت 8 روز در دمای 20 درجه سانتیگراد روی دستگاه تکاندهنده دوّار قرار داده شده بود، بدست آمد.
سوسپانسیونی به غلظت 106 اسپوریدی در هر میلی لیتر که با استفاده از یک لام گلبول شمار تنظیم شده بود، تهیه گردید و به ازای هر لیتر از این سوسپانسیون یک میلی لیتر ماده کاهنده کشش سطحی توین20 (Tween20) اضافه گردید.
گیاهچه‌ها در مرحله 12 روزگی با کشیدن پنبه استریل آغشته به سوسپانسیون اسپوریدی بر برگها مایه زنی شدند.
گیاهان پس از 3 روز نگهداری در زیر یک پوشش پلاستیکی، در شرایط دمایی 3±22 درجه سانتیگراد با برداشتن پوشش‌ها نگهداری شدند.
بسترهای کاشت بدو دسته 22 تایی تقسیم و دسته اول 10 روز پس از مایه‌زنی و پیش از بروز علایم بیماری و دسته دیگر پس از بروز علایم بیماری و بمحض پیدایش پیکنیدها با سه میزان 2، 1 و 5/0 در هزار از سموم پروپیکونازول (Tilt®,250 EC, novartis) و سایپرکونازل (Alto®, 250 EC, novartis) در سه تکرار با مه‌پاش دستی سمپاشی شدند.
چهار ظرف کاشت باقیمانده در هر دسته نیز بعنوان شاهد با آب معمولی تیمار شدند.
دو عدد کیت کامل تشخیصی S.
tritici با امکان انجام 176 آزمون از شرکت ال.
ای.
سی – بیوتست1 فرانسه خریداری گردید.
نمونه برداری‌ها در هر دسته، پس از مایه زنی و پیش از سمپاشی بطور یک در میان، از برگهای دوم و سوم ردیف کاشت و یک هفته پس از اِعمال سمپاشی‌ها از برگهای سوم و دوم انجام شد.
بدین‌ترتیب درصورتیکه برگ دوم یک گیاه برای آزمون اول انتخاب می‌شد، برگ سوم آن نیز برای آزمون دوم مورد استفاده قرار گرفت و برعکس.
آزمون الایزا در دو مقطع زمانی مختلف برای نمونه‌های دسته اول با کیت شماره 1 و دسته دوم با کیت شماره 2 انجام شد.
کیت تشخیصی سپتوتست اختصاصاً برای تشخیص S.
tritici طراحی شده و عملکرد آن بسیار سریع و حساس می‌باشد.
این کیت شامل 96 چاهک در 12 ستون (1 تا 12) و 8 ردیف (A تا H) می‌باشد.
چاهکهای ستون 1 شامل شاهدهای استاندارد مثبت و منفی می‌باشند.
در این چاهکها مقادیر پادگنی معینی در پیوند با پادتن قرار دارند و شاهدی برای اطمینان از سلامت کیت و نیز وسیله‌ای برای ارزیابی آزمون نمونه‌ها می‌باشد (11).
نمونه‌های برگی جمع‌آوری شده از هر یک از بسترهای کاشت به قطعات کوچکی تقسیم و هر کدام بطور جداگانه بکمک یک هاون چینی تمیز و همراه با بافر استخراج نمونه (1 میلی لیتر بافر به ازای هر گرم نمونه برگی) عصاره گیری شد (11).
100 میکرولیتر از هر عصاره پس از عبور دادن از پارچه ململ دو لایه، به کمک یک میکروپیپت تک کاناله با دو تکرار در چاهکهای میکروپلیت ریخته شـده و میکروپلیت به مدت 15 دقیقـه در دمای اطـاق روی یـک شیکر دورانی با سرعت 250 دور در دقیقه قرار داده شد.
پس از این مرحله پوشش پلاستیکی چاهکهای ستون 1 یعنی شاهدهای استاندارد مثبت و منفی برداشته شده و محتویات کلیه چاهکها تخلیه و هر چاهک چهار بار با 400 میکرولیتر از بافر شستشو شسته شد (11).
با استفاده از یک میکروپیپت 8 کاناله 100 میکرولیتر کانجوگیت1 (پیوندی از پادتن و آنزیم نشاندارشده) به هر چاهک اضافه شد.
مراحل تکان و شستشو تکرار و 100 میکرولیتر محلول بستره به هر چاهک اضافه شد (11).
میکروپلیت بمدت 10 دقیقه در دمای اطاق و در تاریکی با همان دور روی شیکر قرار داده شد و بلافاصله مقادیر چگالی نوری هر یک از چاهکها با استفاده از دستگاه الایزا – خوان2 در طول موج620 نانومتر خوانده شد.
منحنی تنظیم جذب نوری3 کیت با یافتن نقاط متناظر مقادیر چگالی نوری4 و واحدهای پادگنی5 چاهکهای ستون 1 ترسیم شد.
مقادیر واحدهای پادگنی چاهکهای ستون 1 در دفترچه راهنمای کیت بصورت دو به دو بترتیب 192، 64، 21 و صفر واحد پادگنی در هر میلی‌لیتر ذکر شده است (11).
جهت ارزیابی سطح آلودگی نمونه‌ها به S.
tritici لازم بود تا مقادیر چگالی نوری هر چاهک به مقادیر واحدهای پادگنی تبدیل شود.
برای این منظور پس از رسم منحنی تنظیم جذب نوری هر کیت و با بدست آوردن معادله سه پاره خط منحنی، مقدار چگالی نوری در معادله مربوط قرار داده شد و مقادیر واحدهای پادگنی هر چاهک محاسبه گردید.
سپس درصد کاهش مقادیر واحدهای پادگنی از حالت قبل از سمپاشی به پس از آن برای تک تک تکرارها با فرمول ابداعی مقابل محاسبه گردید ((A/Á ) - 1)100= R(%) که در آن A مقدار واحدهای پادگنی پس از سم پاشی، Á مقدار واحدهای پادگنی پیش از سمپاشی وR درصد کاهش واحدهای پادگنی می‌باشد.
پس از محاسبه درصد کاهش واحدهای پادگنی تجزیه داده‌ها و مقایسه میانگین هر یک از تیمارها با استفاده از نرم افزار MSTATC و با آزمون دانکن در سطح 5 درصد انجام شد.
نتایج و بحث بررسی چاهکهای شاهد استاندارد کیت نشان داد که در سه نوع چاهکِ استاندارد مثبت بالا، متوسط و پایین یعنی بترتیب چاهکهای A1,B1، C1,D1 وE1,F1 افزایش تدریجی رنـگ آبی بوضوح قابل مشاهده است.
درعین‌حال در شاهد منفی یعنی چاهکهای G1,H1 چگالی نوری کمتر از 1/0 بوده و چاهکهای مذکور بدون تغییر رنگ باقی ماندند.
این امر مؤید صحت عملکرد کیت تشخیصی و بیانگر اطمینان از آزمون می‌باشد.
در برخی از سایر چاهکهای حاوی عصاره نیز تولید رنگ آبی در مقایسه با شاهد منفی بیشتر محسوس بود.
این وضعیّت نشانه آلوده بودن نمونه آزمایش‌شده به S.
tritici بود.
برعکس چاهکهایی با تغییر رنگ کمتر نسبت به شاهد منفی، فاقد آلودگی تلقّی شدند (11).
مقایسه میانگین درصد کاهش واحدهای پادگنی در دو حالت پیش و پس از بروز علایم نشان داد که این دو اختلاف بسیار معنی‌داری با هم دارند و این به معنی تأثیر به مراتب بیشتر سمپاشی‌هایی است که پیش از بروز علایم انجام شده است (نمودار 1).
مقادیر اندازه‌گیری شده واحدهای پادگنی پس از سمپاشی با سه میزان 2 ، 1 و 5/0 در هزار سایپروکونازول و پروپیکونازول نیز حاکی از آن است که با اعمال سمپاشی‌ها پس از بروز علایم، مقادیر بمراتب بالاتری از واحدهای پادگنی در گیاه، بدون تأثیر باقی می‌مانند (جدول 1).
این مقادیر درواقع نشاندهنده کم‌تأثیرماندن قارچ عامل بیماری در نمونه‌های گیاهی از سموم مورد استفاده و امکان گسترش مجدد و از سرگرفته شدن آلودگی و در نتیجه از بین رفتن تأثیر قارچکش بکاررفته می‌باشد.
بررسی مقادیر کاهش واحدهای پادگنی پس از سمپاشی با سم پروپیکونازول پیش از بروز علایم بیانگر این مسئله است که در واقع میتوان میزان مصرف سم را تا حد 1 در هزار کاهش داد، چراکه سمپاشی پیش از بروز علایم با میزان 1 و 2 در هزار سم پروپیکونازول اختلاف معنی داری را نشان